革蘭氏染色液

保質期：2-8度一年.

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，媒染劑碘液進入菌體后與結晶紫結合，革蘭氏陽性菌對碘與結晶紫攝取量多且牢固，不易被酒精脫色。革蘭氏陰性菌對碘與結晶紫攝取量少，不牢固，易被酒精脫色。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。

革蘭氏染色液操作步驟：

1、標本處理：
（1）.有菌部位的標本，如痰液、糞便、各種拭子、創面等可直接涂片。
（2）.無菌部位的標本，如腦脊液、胸水、腹水、膽汁、尿液、關節液等，應取適量標本（zui高可達5-7ml）,經3000rpm 離心10min.，取沉渣涂片染色。

2、涂片制作：菌液涂片時，用接種環沾取菌液點在載玻片上，標本可直接在玻片上涂布；菌落涂片時，先取生理鹽水一滴，置玻片上，用接種針挑取菌落在鹽水中涂布。制作的涂片應自然干燥，并經火焰固定，固定的溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準，否則可能使細菌形態改變。將固定后的涂片進行染色。

3、染色方法：

革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能會呈陰性反應。

（1）.加上結晶紫后，染色1分鐘，水洗。

（2）.加上碘液后染色1分鐘，水洗。

（3）.加上95%酒精,搖動玻片,根據涂片厚度,脫色約30-60秒，水洗,吸去水分。

（4）.加上蕃紅后，染色1分鐘，水洗。

（5）.吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢。

4．結果觀察：紫色為革蘭氏陽性，紅色為革蘭氏陰性。

注意事項：

1．標本涂片不能太厚，嚴格按操作要求進行。

2．玻片通過火焰溫度不能太高。

3．若涂片較厚，應延長脫色時間，直至不再出現紫色為止。

4．碘液變透明，則不能使用。

5.水洗時動作要輕柔,沿載玻片對角線方向用洗瓶沖洗,以免把菌體沖掉。

如果用量少，買現成的比較話算，如果用量大，自己配起來也溶液，就是試劑種類多了點。其配制方法如下：

(1)結晶紫(crystal violet)液：結晶紫乙醇飽和液(結晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL 將兩液混勻置24h后過濾即成。

(2)盧戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化鉀0.66g，蒸餾水100mL。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之*溶解，再加蒸餾水至100mL即成。配成后貯于棕色瓶內備用，如變為黃色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脫色，脫色后可選用以下(4)或(5)的其中一項復染即可。

(4)番紅溶液：番紅O(safranine，又稱沙黃O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。